Международная группа исследователей создала такую методику микроскопии, которая позволит увеличить мозг до размеров, позволяющих увидеть даже самые мелкие части нейронов без каких либо структурных повреждений нервной ткани. Метод описан на страницах журнала Science.
Двое ученых, Руйсюань Гао (Ruixuan Gao) и Шох Асано (Shoh M. Asano) из Медицинского института Говарда Хьюза, воспользовались техникой экспансионной микроскопии, благодаря которой можно изучать образцы мозга, увеличенные в 4 раза (раздутые, как воздушные шары). Такая техника хорошо работает на одиночных клетках или тонких тканевых срезах, которые можно разглядеть в обычные световые микроскопы. Однако команда из лаборатории под руководством Эдварда Бойдена (Edward S. Boyden) из Массачусетского технологического института планировала разглядеть целые нейронные сети протяженностью в миллиметр и более, что достаточно трудно сделать технически.
С этой целью они обратились к коллегам, в чьей лаборатории имелся решетчатый световой микроскоп, который позволял в динамике наблюдать быстрые субклеточные процессы чувствительных живых клеток в 3D. И сочетание двух методов микроскопии потенциально открыло возможность быстрого получения детальных изображений широких участков мозговой ткани.
Научные группыобъединились и отсканировали весь мозг плодовой мушки, а также участки мозга мыши толщиной с кору. Их комбинированный метод обеспечил высокое разрешение с возможностью визуализации любого желаемого белка, и все это происходило весьма быстро. Получение изображений мозга мухи в нескольких цветах заняло всего 62,5 часа, по сравнению с годами, которые потребовались бы на ту же работу с использованием обычного электронного микроскопа.
Такая высокая скорость и разрешение позволят ученым задавать новые вопросы. Например, о различии мозга самцов и самок или о вариативности нейронных связей у мух одного типа. Группа Бойдена мечтает сделать карту мозга настолько детальной, что появится возможность моделировать симуляцию мозга на компьютере.
«Мы вышли на новый уровень точности изображения, вот почему мы настолько взволнованны. Мы не просто сканируем больше мозговой ткани – мы сканируем весь мозг», – отмечает исследователь.
Несколько лет назад его группа изобрела новый метод: добавляя в срезы набухающий гель, получилось «растянуть» ткань так, что пространство между молекулами увеличивалось, и становилось возможным изучать их под микроскопом. Молекулы фиксировались в гелевом каркасе, сохраняя свое расположение после растяжки. Кстати, в прошлом году появилась работа, позволяющая этот метод усовершенствовать.
Но сканировать образцы большого объема затруднительно. Чем толще образец, тем сложнее осветить только ту часть, которую вы желаете разглядеть. В то же время слишком большое количество света провоцирует фотообесцвечивание.
Кроме того, расширение образца в четыре раза увеличивает его объем в 64 раза, поэтому скорость визуализации также становится первостепенной. Чтобы справиться с этими трудностями, исследователи воспользовались решетчатым световым микроскопом, который пропускает ультратонкий слой света через образец, освещая только ту часть, которая находится в фокусе микроскопа. Это помогает областям вне фокуса оставаться темными, тем самым предотвращается гашение флуоресценции образца.
Когда Гао и Асано впервые рассмотрели растянутые ткани мыши на решетчатом микроскопе, они увидели большое количество светящихся шипов, выступающих из ветвей нейронов. Эти дендритные шипики часто выглядят как грибы с выпуклыми головками на тонких шейках, которые трудно измерить. Но ученые смогли увидеть даже «самые маленькие шейки», одновременно получив изображения синаптических белков поблизости
В итоге нейробиологи и команда FlyLight представили высококачественные образцы мозга плодовых мушек, которые Гао и Асано расширили и собрали около 50 000 кубов данных с каждого мозга, сформировав подобие трехмерного паззла. Эти изображения затем «сшили», проводя сложные вычисления, и из 200 объединенных терабайт данных получилисьфильмы, которые подробно демонстрируют мозг в ярких цветах. Ученые исследовали более 1500 дендритных шипиков, получили изображения миелиновой оболочки на разных участках аксонов, выделили все дофаминергические (производящие дофамин) нейроны и посчитали все синапсы в целом мозге мухи.
Техника расширения, придуманная командой Бойдена, хорошо подходит для области применения решетчатого микроскопа: с помощью нее получаются почти прозрачные образцы. Тем не менее проблемы остаются. По словам авторов, как и при любой флуоресцентной микроскопии высокого разрешения, может быть сложно декорировать белки достаточным количеством флуоресцентных меток, чтобы получалось их четко видеть с высоким разрешением. А поскольку для расширенной микроскопии требуется много этапов обработки, вероятность появления артефактов повышается.
Теперь команда строит новый решетчатый световой микроскоп, который планируется перевезти в лабораторию Бойдена в Массачусетском технологическом институте.
«Мы надеемся быстро создать карты всей нервной системы», – говорит Бойден.
Текст: ДианаГалимова